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KD2792|kingmorn|2×Power Pfu PCR MasterMix 50μl体系/次 促销产品

2×Power Pfu PCR MasterMix是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液,含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR,大大简化操作过程。

价 格 200

市场价 ¥0.00

销量: 12

关注: 268

快递: ¥20.00

200

数量15

品牌

kingmorn

货号

KD2792

产品规格

1ml 40T 1ml*5 200T

数量

(库存15件)

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产品参数

产品详情 常见问题 产品参数 产品评价

  • 产品参数
  • 品牌kingmorn

  • 产品名称KD2792|kingmorn|2×Power Pfu PCR MasterMix 50μl体系/次

  • 产品货号KD2792

  • 产品规格1ml 50T,1ml*5 200T

  • 保存温度-20℃

2×Power Pfu PCR MasterMix

Cat. #:KD2792


产品简介

2×Power Pfu PCR MasterMix是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液,含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR,大大简化操作过程,缩短操作时间,降低污染(加样次数减少)。同时,由于体系内含有优化剂与增强剂,能够显著增强PCR扩增的灵敏度。扩增产物具有平末端。

Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70-75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。


产品组成

Component

KD2792

KD2792

2× Pfu Mix

1 ml

1 ml× 5

超纯水

1 ml

1 ml× 5

本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品,PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如无特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。


保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。


应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

2×Power Pfu PCR MasterMix

 

25   μl

2

upstream   primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4   μM

3

downstream   primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4   μM

4

template   DNA[2]

1-4   μl

<1μg

5

超纯水

To   50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR   Enhancer

Variable

-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[2] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

Template

人类基因组DNA

λDNA

大肠杆菌基因组DNA

质粒DNA

Dosage

0.1μg-1μg

0.5ng-5ng

10ng-100ng

0.1ng-10ng

 

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage  

Temperature

Time

Number   of Cycles

Initial   Denaturation

94℃

3   min

1

Denaturation

94℃

30   sec

25-35  

Annealing

55-68℃[1]

30   sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final   Extension

72℃

5-10   min

1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量。


操作注意事项

1、室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2、Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃,15-30min)

PCR(纯化)产物

1-7   μl

10×   Taq BufferMg2+Plus

1   μl

dATP  

0.2   mM

Taq   DNA聚合酶

5U

超纯水

To   10 μl

3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。

4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。


引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

 


Q:PfuMix的反应体系与普通Pfu DNA聚合酶的反应体系有何不同?

答:PfuMix的反应体系中除Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg2+等常规组分外,还包含适当比例的PCR Enhancer与稳定剂。而且,反应体系中的离子种类

与浓度也有所区别。

 

Q:为什么PfuMix的灵敏度与扩增效率会高于普通Pfu DNA聚合酶?

答:这是由于东盛对PfuMix反应缓冲液中的成分与浓度进行了优化。我们在PfuMix反应缓冲液中添加了适当比例的PCR Enhancer,提高了聚合酶的热稳定性,

显著降低DNA二级结构对于PCR扩增的影响。同时,对PfuMix反应缓冲液中的离子浓度与比例进行优化,使得聚合酶处于最适活性状态,从而获得了最佳的

扩增效率。

 

Q:PfuMix的保真性与扩增片段长度是多少?

答:PfuMix的保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍。对于简单模板,PfuMix可扩增2 kb以下的片段。

 

Q:PfuMix的扩增产物能否直接进行TA克隆?

答:不可以直接进行TA克隆。建议对PCR产物纯化后,加A再进行TA克隆。


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产品详情

2×Power Pfu PCR MasterMix

Cat. #:KD2792


产品简介

2×Power Pfu PCR MasterMix是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液,含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR,大大简化操作过程,缩短操作时间,降低污染(加样次数减少)。同时,由于体系内含有优化剂与增强剂,能够显著增强PCR扩增的灵敏度。扩增产物具有平末端。

Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70-75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。


产品组成

Component

KD2792

KD2792

2× Pfu Mix

1 ml

1 ml× 5

超纯水

1 ml

1 ml× 5

本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品,PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如无特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。


保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。


应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

2×Power Pfu PCR MasterMix

 

25   μl

2

upstream   primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4   μM

3

downstream   primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4   μM

4

template   DNA[2]

1-4   μl

<1μg

5

超纯水

To   50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR   Enhancer

Variable

-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[2] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

Template

人类基因组DNA

λDNA

大肠杆菌基因组DNA

质粒DNA

Dosage

0.1μg-1μg

0.5ng-5ng

10ng-100ng

0.1ng-10ng

 

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage  

Temperature

Time

Number   of Cycles

Initial   Denaturation

94℃

3   min

1

Denaturation

94℃

30   sec

25-35  

Annealing

55-68℃[1]

30   sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final   Extension

72℃

5-10   min

1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量。


操作注意事项

1、室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2、Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃,15-30min)

PCR(纯化)产物

1-7   μl

10×   Taq BufferMg2+Plus

1   μl

dATP  

0.2   mM

Taq   DNA聚合酶

5U

超纯水

To   10 μl

3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。

4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。


引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

 




常见问题

Q:PfuMix的反应体系与普通Pfu DNA聚合酶的反应体系有何不同?

答:PfuMix的反应体系中除Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg2+等常规组分外,还包含适当比例的PCR Enhancer与稳定剂。而且,反应体系中的离子种类

与浓度也有所区别。

 

Q:为什么PfuMix的灵敏度与扩增效率会高于普通Pfu DNA聚合酶?

答:这是由于东盛对PfuMix反应缓冲液中的成分与浓度进行了优化。我们在PfuMix反应缓冲液中添加了适当比例的PCR Enhancer,提高了聚合酶的热稳定性,

显著降低DNA二级结构对于PCR扩增的影响。同时,对PfuMix反应缓冲液中的离子浓度与比例进行优化,使得聚合酶处于最适活性状态,从而获得了最佳的

扩增效率。

 

Q:PfuMix的保真性与扩增片段长度是多少?

答:PfuMix的保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍。对于简单模板,PfuMix可扩增2 kb以下的片段。

 

Q:PfuMix的扩增产物能否直接进行TA克隆?

答:不可以直接进行TA克隆。建议对PCR产物纯化后,加A再进行TA克隆。




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  邮箱:  qm@cmorn.com 

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