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线性PEI转染试剂的使用方法

发表时间:2019-06-28 18:19:24

作 者:cmorn

来源:cmorn

关注:55

线性PEI转染试剂是一种阳离子聚合物,它能与核酸形成复合物,并使该复合 物进入哺乳动物细胞。线性PEI转染试剂广泛适用于常见细胞系,如 HEK-293、HEK293T、 Hep G2、Hela、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3 和 Sf9 等。该试剂即使在有血清存在的情况下, 它仍然能高效的将核酸导入细胞。

线性PEI转染说明书

名称:线性PEI转染试剂

化学名:线性聚乙烯亚胺

CAS#:9002-98-6

MW:25KD,40KD

用途:用于转染核酸到哺乳动物细胞

产品编号:KE1082

包装规格:1ml

储存条件:室温

 

产品概述 :

线性PEI转染试剂是一种阳离子聚合物,它能与核酸形成复合物,并使该复合 物进入哺乳动物细胞。线性PEI转染试剂广泛适用于常见细胞系,如 HEK-293、HEK293T、 Hep G2、Hela、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3 和 Sf9 等。该试剂即使在有血清存在的情况下, 它仍然能高效的将核酸导入细胞。

线性PEI转染试剂具有如下优点:

  • 优越的转染效率
  • 重组蛋白的高表达水平
  • 与含血清的培养基相兼容
  • 低细胞毒性,易于操作

质量控制:

每批次线性PEI转染试剂均经过转染测试。将 eGFP 表达质粒用 PEI转染试剂转入亚融合状态的293T细胞,转染 16 h 后, 超过 95%的细胞表达 eGFP。

注意事项 :

一.质粒质量,请务必使用高质量转染级无内毒素质粒。通过 260 nm 光吸收测定 DNA 浓度,260 nm / 280 nm 比值确定 DNA 纯度(比值应该在 1.8~2.0 的范围之内)。如有可能,请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

二.细胞条件,使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞,请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO公司血清培养细胞。

瞬时转染方法:

一. 接种细胞, 转染前一天,用胶原酶消化细胞并计数(不建议用胰酶)。调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

二.准备 DNA-PEI 复合物, DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 2-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液 的试管,一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中(注意:请勿颠倒添加顺序)。充分混匀后,室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时,请用圆底聚丙烯管,例如 Falcon 5 mL /14 mL 离心管。

三.转染细胞,直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时,去除生长培养基,替换成无血清培养基,然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后,添加1/2体积的包含 30%血清的生长培养基。

四.孵育细胞和分析结果,在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后最快 7 h 即可检测到转入基因的表达。 请自行确定最适合检测时间。

 

稳定转染方法:

一.接种细胞,转染前一天,用胰酶消化细胞并计数。调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

二.准备 DNA-PEI 复合物: DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 2-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液 的试管,一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中(注意:请勿颠倒添加顺序)。充分混匀后,室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时,请用圆底聚丙 烯管,例如 Falcon  5 mL /14 mL 离心管。

三.转染细胞,直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时,去除生长培养基,替换成无血清培养基,然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后,添加1/2体积的包含 30%血清的生长培养基。

四.孵育细胞和分析结果: 在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后最快 7 h 即可检测到转入基因的表达。

五.转染 24 h 后,将细胞传代至新鲜的生长培养基中(将细胞稀释 10 倍 以上),在 CO2培养箱中 37℃孵育过夜。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约 1~2 周可筛选到耐药性克隆,在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。

 


参考用量:


细胞培养容器

表面积

稀释液体积

DNA的量

PEI溶液的量

培养基总量

96-well

0.3cm2

10uL

0.1ug

0.1uL

100uL

48-well

0.7cm2

20uL

0.2ug

0.3uL

200uL

24-well

1.9cm2

50uL

0.5ug

1uL

500uL

12-well

3.8cm2

50uL

1ug

2uL

1mL

6-well/35mmdish

10cm2

100uL

2ug

4uL

2mL

60mm dish/T25flask

21cm2

200uL

4ug

8uL

4mL

100mmdish/T75flask

58cm2

500uL

10ug

20uL

10mL

 

特别提醒:

一. 对于某些类型的细胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 细胞,在转染前两天铺板可显著提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板,可适当降低铺板密度,以确保转染时细胞 的汇合度仍为 70~80%。

二.对于接触抑制敏感的细胞,可适当降低铺板密度。

三. 即使在有蛋白(如 10%的血清)存在的情况下,DNA-PEI复合物仍能转染细胞,但是 DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。我们推荐使用 Opti-MEM ITM 培养基以达到最佳转染效率。其他的无蛋白培养基则需测试与线性PEI转染试剂的兼容性。

四.对大多数细胞而言,每1ug使用3.0ulKingmorn® DNA transfection reagent转染试剂都能获得较高转染效率。使用者也可尝试每 1 ugDNA 使用 1~4 ul体积线性PEI转染试剂进行优化。


转染案例:



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