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WB检测磷酸化蛋白的实验方案

发表时间:2018-08-31 11:15:55

作 者:EAA

来源:abcam

关注:103

磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。

检测磷酸化蛋白的实验方案

将细胞或组织样品在裂解缓冲液中匀浆,裂解缓冲液需新鲜制备,加入蛋白酶抑制剂(检测磷酸化蛋白时还应加入磷酸酶抑制剂)。
一旦开始裂解,蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在 4 °C,并在一开始就向裂解缓冲液中新鲜加入合适的抑制剂,能够显著减缓这些反应。
使用加入了新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 或 NP40 缓冲液。


研究磷酸化时,请记得向裂解液中加入磷酸酶抑制剂


1. 向含有 1-100 ng 靶蛋白(500 µg 裂解物)的蛋白样品中加入等体积的 2x SDS-PAGE 样品缓冲液。对于还原样品,样品缓冲液中应该同时加入 DTT 或 β-巯基乙醇。对于非还原样品,不加入 DTT 或β-巯基乙醇。

2. 将样品加热到 95 °C 或煮沸 5 分钟,使蛋白变性。

3. 上样并在标准条件下跑胶。

4. 通过半干法或湿法将蛋白转印至 PVDF 膜上。请注意:PVDF 膜必须预先在甲醇溶液中湿润后。

5. 如有需要,可以在丽春红染料中对膜进行简单地(10 秒)染色,以确定转膜效率。可以用 PBST 或 TBST 清洗去除染料。我们不建议在蒸馏水中清洗,因为某些情况下可能会使蛋白质脱落下来。

6. 在 TBST 中加入 5% w/v BSA 对膜进行封闭。在摇床上 4 °C 孵育 1 小时。

7. 使用 TBST 稀释一抗至建议稀释度。我们推荐在封闭的袋子、杂交管或 50 mL Falcon 管(约 2.5 mL缓冲液)中进行孵育。在摇床上 4 °C孵育过夜。

8. 室温下使用 TBST 洗膜 3 至 4 次,每次 5 分钟。

9. 在 TBST 中,按照建议的稀释度(虽然需要对特定应用进行优化,1/5000 是较好的通用工作稀释度)稀释 HRP 二抗。

10.室温下使用 TBST洗膜 3 至 4 次,每次 5 分钟。

11.进行 ECL Plus 检测。


使蛋白保持在磷酸化的状态!加入充足的磷酸酶抑制剂,并始终将样品置于冰上。
使用 5% w/v BSA (fractionV) 而非牛奶(牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白;而抗体会检测牛奶中的酪蛋白导致高背景)封闭膜。
请记住磷酸化可能需要被诱导。信号弱或无信号可能意味着诱导不充分。建议使用推荐的阳性对照。

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