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胎牛血清使用中遇到的常见问题总结

发表时间:2018-11-02 01:27:14

作 者:we

来源:互联网

关注:157

胎牛血清使用中遇到的常见问题总结

1、特级胎牛血清使用方法

在细胞培养过程中,经常加入5%-20%的胎牛血清,最常使用的胎牛血清浓度是10%。高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱,影响后续实验的结果,我们在实验中使用10%的南美胎牛血清培养293T细胞,效果非常好。但是有些细胞也会使用5%的FBS或者20%的胎牛血清,要根据具体细胞选择合适的胎牛血清浓度。

2、 如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损?

将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。待全部溶解后再分装,一般以50ml无菌离心管可分装40~45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沈淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。 

长时间储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此,推荐在-20℃以下储存血清,并避免反复冻融。

我们建议血清应保存在-20℃。若存放于4℃时,请勿超过一个月。切勿将血清在 37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会被破坏,而影响血清质量。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。血清在冻入低温冰箱前,必须预留一 定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

3、血清中包含絮状沉淀,它们是什么,怎么处理?

血清中的沉淀物絮状物主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除,大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。所以,使用产品时要摇动并加热血清至37℃,沉淀会自然消失,也可不用处理。

显微镜下“小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。

一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。

4、实验室如何选择适合的血清?

国外一般认为GIBCO比HYCLONE好,两种价格普遍偏贵,一般不是太娇气的细胞,国产的就够用了。国内做血清比较好的有四季青血清。此外,由于国内HYCLONE,GIBCO并没有生产线,我们只能从代理商那里买,而代理商又鱼龙混杂,所以订购时要特别注意。有的国外生物公司由于刚刚进入中国,知名度不高,但是其实在国外已经做得很不错了,如gimini、bioind等,他们在国内有办事处,价格相对优惠很多。

5、 如何避免血清中产生沉淀?

按如下操作可避免沉淀的产生:

(1)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

(2) 血清分装冻存时,须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一。

(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

(4) 勿将血清置于37℃太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏,从而影响血清的品质。

(5) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

(6) 若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

6、 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗?

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

7、 为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学 研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量。

8、 有必要做热灭活吗?

实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物 的分裂扩增。

若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量!

9、细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理?

一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成,首先,要肉眼观察培养基是否混浊,然后,在镜下观察培养细胞生长的状态,黑点是否游动。如果细胞被污染,微生物则会大量繁殖,培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。

如果在镜下观察细胞,生长状态良好,与黑点出现前相比,没有任何变化,那么,黑点的出现可能与以下几种情况有关:

(1)细胞生长过老,破碎的细胞残骸;

(2)血清质量不好,反复冻融的结果;

(3)配制培养基的pH值偏高,不宜细胞生长;

(4)配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点;

(5)培养原代细胞中出现小黑点,可能是原代组织中的杂质,多次传代可以消除。

10、 细胞培养中如何防止黑点生成?

(1) 尽可能地减少血清冻融次数。

(2) 培养基无需37℃水浴。

(3) 培养基保持最佳PH值7.0- 7.2。

(4) 严格控制配制培养基的水质,容器定期刷洗。

(5) 掌握细胞传代的最佳时机,细胞切勿生长过老。

11、小牛血清和胎牛血清有何区别与注意事项?

来源不同:胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清,新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。

组份与比例不同:两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同,用途与用法不同:某些细胞必需胎牛血清才能生长,而有些细胞只需小牛血清即可,使用浓度不同,一般在5%-10%,有特殊要求的浓度在20%。

血清保存和使用须注意:血清应保存在-5℃至-20℃,若存放在4℃不可超过一个月。解冻血清时 ,应先将血清至于2-8℃冰箱,并经常摇匀使之溶解,然后至室温放置使之升温,绝对不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中,如放在37℃解冻,颜色加深,粘稠度也会增加,血清在解冻和热灭活后,应按用量分装并于-20℃保存,避免反复冻融。


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