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免疫组化操作流程

发表时间:2018-12-25 21:57:19

作 者:affnity

来源:affnity

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免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技(immunocytochemistry)。

免疫组化操作流程

 

Step1. 烤 片

烤片的目的是将带有蜡的组织切片牢固地黏在载玻片上,以免染色过程中切片脱落。切片在56~60℃的恒温箱中至少放置1 小时才能达到此目的,通常为2~6 小时,肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可。由于高温干燥可加速组织中抗原的氧化,因此高温烤片对抗原有破坏    作用,可能导致阳性降低,染色定位错误。


Step2. 脱蜡和水化

分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15~30 分钟,以脱掉组织中的蜡。但是,进人组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶,故需进一步通过下行梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替代出来。 切片在100%乙醇工、Ⅱ中分别浸泡5 分钟,95%、90%、80%和70%乙醇中分别浸泡2分钟,PBS 漂洗 3 次,每次 3 分钟,置蒸馏水中待用。


Step3. 抗原修复

推荐使用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法,适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织 切片的抗原修复,其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠。方法:取一定量pH=6.0 柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中,大火加热直至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖,扣上压力阀,继续加热至喷汽,从喷汽开始计时,3-4 分钟后,压力锅离开热源,冷却至室温,取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次,每次3 分钟(2×3')。

 

Step4. 细胞膜打孔

切片置于0.1%~0.3%TritonX-100 中,室温浸泡25 分钟,PBS 冲洗3 次,每次5 分钟。TritonX-100 为去污剂,其脂溶性可使细胞膜穿孔,增加细胞膜对抗体的渗透性。检测细胞膜抗原时可免去此步骤。

  

Step5. 灭活内源性酶及封闭内源性生物素

切片浸泡在3%的H2O2 中20 分钟,PBS 冲洗3 次,每次5 分钟。在一些细胞中存在过氧化物酶和过氧化氢酶等,最常见的是红细胞(血红蛋白,另外还有横纹肌细胞(肌球蛋白粒细胞和单核细胞(细胞色素、肝细胞和肾细胞(过氧化氢酶等,内源性H2O2 酶会导致底物H2O2 分解,DAB 沉淀。

3%H2O2 要现用现配,洗H2O2 时用的PBS 要与洗其它用的PBS 分开。用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS 可能好在保护抗原和固定组织作用,过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

  

Step6. 非免疫血清封闭

抗体能被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附。从而导致背景着色,为了防止这种现象发生,最好在特异性抗体处理切片之前,选择与二抗种属相同的非免疫血清封闭电荷, 阻止一抗与之结合,抑制非特异性背景着色。常用方法是用2%~10%羊血清或2%~5%牛血清白蛋白在室温下作用10~30 分钟。但应注意此种结合不牢固,所以最好不要冲洗,倾去余液直接加一抗。

 

Step7. 一抗孵育

滴加特异性一抗于切片上,4℃孵育过夜(冰箱拿出后可37℃复温45 分钟),也可在37℃孵1~2 小时。之后,用PBS 冲洗3 次,每次5 分钟。稀释特异性抗体常用含1%~3%非免疫血清的PBS,需现配现用,稀释后的一抗存放时间不可超过三天。不同组织中目的蛋白含量有差异,因此抗体稀释比应参考抗体说明书推荐浓度做梯度稀释,确定最适浓度。 注:不要干片,试剂要充分覆盖组织,应超出边缘2mm,用 PAP Pen 时要超出3-4mm。

 

Step8. 二抗孵育

滴加稀释度合适酶标二抗于切片上,室温孵育30-60min,继而PBS 漂洗3 次,每次5 分钟。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分,特异性要与一抗匹配,否则,一抗和二抗连接有误可导致假阴性染色结果。例如,兔抗鼠或人的一抗需与抗兔的二抗匹配,小鼠抗大鼠或人的一    抗需与抗小鼠的二抗匹配。

注:如二抗为生物素标记,还需要滴加链酶亲和素-HRP。

 

Step9. 显 色

显色是免疫组化染色的最后关键步骤,一般过氧化物酶的检测系统选用DAB 或AEC 显色。前者显色为棕色,后者为红色。要得到最佳的显色效果,必须在镜下严格控制,以检出物达到最强显色效果而背景无色为终止点。根据经验,DAB 在配制后最长放置时间是30 分钟以内,过时则不能使用,DAB 滴加到组织切片时作用时间最长不宜超过10 分钟(最好在5 分钟内),否则不管有无阳性结果均应终止反应。对一些富含内源性酶的组织用DAB 显色时极易出现背景色,应尽早在镜下控制,以达到最佳分辨效果。DAB 有致癌作用,故操作时应戴手套,尽量避免与皮肤接触,用后及时洗手,接触DAB 的实验用品最好经洗液浸泡24 小时后方能再次使用。AEC 显色系统的弊端是易溶于有机溶剂,所以封片时应以水性封片剂为主,故染色切片不能长期保存。免疫酶染色时,酶底物浓度的增加或孵百盯面雨延长,均可增强染色强度。过氧化物酶显色时,H2O2 浓度较大使显色反应过快而致背景加深,且过量H2O2 能抑制酶的活性,故H2O2 浓度要适中。

 

如果上述步骤使用链霉亲和素―生物素―碱性磷酸酶复合物,则需选用NBT/BCIP 作为显色系统.阳性结果为蓝黑色。显色后蒸馏水或自来水冲洗。采用碱性磷酸酶作为标记物底物时, 染色过程中的缓冲液用0.02mol/LTBS(pH 8.2)较好。

  

Step10. 苏木精复染细胞核

为使组织切片清晰的显示组织结构,便于准确定位,常对切片进行复染。最常使用的细胞核染料为苏木精,也可根据情况使用甲基绿和核快红。染色约10 秒,镜下控制着色程度,效果好时自来水冲洗返蓝。

  

Step11. 封 片

如果选用DAB 显色,则切片经过梯度乙醇脱水(80% 乙醇2 分钟,95%乙醇2 分钟),乙醇Ⅰ和100%Ⅰ乙醇Ⅱ各5 分钟,二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明5 分钟,最后中性树脂封固;如果选用AEC 显色,则切片不能经乙醇脱水,冲洗后拭干直接用水性封片剂封片。


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